ブックタイトル平成26年度「学校法人日本赤十字学園教育・研究及び奨学金基金」教育・研究事業報告書

概要

平成26年度「学校法人日本赤十字学園教育・研究及び奨学金基金」教育・研究事業報告書

抗体反応をブロックするため、組織を0.4% Triton X-100、4%ヤギ血清を含有するPBS（以下ブロッキング溶液）に室温1時間浸漬した。その後、ブロッキング溶液にHoechst 33342（20μg/ml）とAlexa 647でラベルしたCD31抗体（10μg/ml）（BioLegend社）を溶解し、1晩反応させた。リン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline: PBS）で10分ずつ3回洗浄し、メタノール置換（50%メタノール10分1回、100%メタノール10分2回）を行った後、benzyl alcoholとbenzyl benzoateを1:2に混合した溶液（BABB溶液）に一晩浸漬し、組織を透明化した。余分なBABB溶液をふき取り、カバーグラスをかけて封入、観察した。３．画像処理法共焦点レーザー顕微鏡LSM510（Carl Zeiss社）を用い、スキャン面を移動させて連続する組織平面像を撮影した。レーザー照射が組織の深部に至るにつれ、撮影される像の輝度、コントラストが低下するため、共焦点レーザー顕微鏡画像用のソフトZEN2012（Carl Zeisss社）で、輝度、コントラストの平均化を行った後、一連の平面像をTag Image File Format（TIFF）形式で出力した。Volume Extractor Ver. 3.0（i-plants systems社）を用いて、出力した一連の平面像より立体像を構築した。両眼視用のステレオ画像は、VolumeExtractorの「カメラ」機能により、立体像を左右に10°回転させた画像を作成の後、StereoPhoto Maker Ver.5.05（須藤, 2014）で右側回転した画像を左に、左側回転した画像を右に配置し、交差法による立体視画像を合成した。４．3Dプリンターへの出力3Dプリンターは、今日、各社から様々な出力方式のものが出ているが、事実上3D System社が開発したSTL (Stereolithography)ファイル形式が標準フォーマットとなっている。前項３で構築した立体画像を3Dプリンター出力用に変換するために、Volume ExtractorVer. 3.0を用いて次の１）から４）の作業を実施し、STLファイルに出力した。１）構造物の等値化共焦点レーザー顕微鏡撮影画像には輝度のグラデーションがあるが、この作業により出力部分と非出力部分を明確化する。２）ポリゴン形式への変換構造物を三角形のパッチの集合体（ポリゴン）で表現する。３）ノイズの除去、構造物表面の平滑化（必要に応じて実施）４）画像の抽出（必要に応じて実施）プレゼンテーションで必要な構造物を領域拡張法により抽出、あるいは不要な構造物を除去する。以上の作業の後、作成されたSTLファイルを実際に3Dプリンターで出力するが、ポリゴ25